ใบมีรสเผ็ดร้อนเมาเบื่อฉุน มีสรรพคุณเป็นยาระงับประสาท ทำให้นอนหลับ ทำให้ผอม เพราะมีสารสงบประสาทที่ไประงับความอยากอาหาร ใช้ทำเป็นยาเส้นผสมกับปูนแดงและใบเนียม ใช้ปรุงยานัตถุ์แก้หวัดคัดจมูก แก้หอบหืด ขับเสมหะ ทำให้อาเจียน ช่วยขับพยาธิในลำไส้ ช่วยขับปัสสาวะ แก้นิ่ว ในการใช้ภายนอกจะใช้ใบยาสูบเป็นยาสมานบาดแผล ชาวกะเหรี่ยงแดงจะใช้เป็นยาประคบเพื่อช่วยห้ามเลือด ช่วยแก้พิษงู ช่วยแก้ลมพิษ ช่วยแก้ปวด ลดอาการบวม แก้ปวดข้อ ปวดศีรษะ ปวดฟัน ใช้รักษาเหา ให้ใช้ใบยาสูบแก่ที่ตากแห้งแล้ว 1 หยิบมือ นำมาผสมกับน้ำมันก๊าดประมาณ 3-4 ช้อนแกง แล้วใช้ชโลมทั้งน้ำและยาเส้นลงบนผมทิ้งไว้ประมาณ 1 ชั่วโมง แล้วสระออกให้สะอาด โดยให้ทำติดต่อกันประมาณ 3-4 วัน ชาวอินเดียนพื้นเมืองจะใช้ยาสูบเป็นยาแก้ปวด โดยเฉพาะการปวดท้องคลอด ด้วยการนำมาสูบ กิน หรือใช้เป็นยานัตถุ์

รากใช้เป็นยารักษาโรคผิวหนัง กลากเกลื้อน เรื้อนกวาง ผื่นคัน หิด

ยาเส้นใช้เป็นยาถอนพิษ รักษาแผลน้ำร้อนลวก ด้วยการใช้ยาเส้นหรือยาตั้ง 1 หยิบมือ นำมาคลุกกับน้ำมันมะพร้าวปิดบริเวณที่ถูกน้ำร้อนลวก จะช่วยถอนพิษได้

นิโคตินในทางยานิโคตินถูกนำมาใช้เป็นยาแก้ไข้มาลาเรีย แก้โรคทางเดินปัสสาวะอักเสบ แม้ว่าบุหรี่จะทำให้ร่างกายเป็นโรค แต่สารนิโคตินในบุหรี่ก็สามารถเป็นยาสำหรับบางคนได้ เพราะทำให้คนที่เป็นโรคพาร์กินสัน โรคจิตเภท โรคอัลไซเมอร์ ฯลฯ ทำงานดีขึ้น เพราะในคนที่เป็นโรคพาร์กินสันและอัลไซเมอร์นั้น สมองจะขาด Dopamine แต่สารนิโคตินนั้นสามารถไปกระตุ้นการหลั่ง Dopamine ได้ ทำให้คนที่เป็นอัลไซเมอร์มีความจำดีขึ้น ส่วนคนที่เป็นโรคพาร์กินสันร่างกายก็จะไม่กระตุกมาก เป็นต้น